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非小细胞肺癌（NSCLC）是一种主要的肺癌类型，也是世界上最常见的癌症之一。近年来，免疫疗法成为治疗NSCLC的热门领域。经过几十年的发展，免疫疗法已经证明了其在几种癌症类型中产生持久反应的能力。免疫检查点抑制剂（ICI），尤其是针对PD-1轴的抑制剂，已经在过去十年中改变了NSCLC的治疗。ICI首先被证明可以改善晚期NSCLC的二线或后期治疗效果。与化疗相比，ICI在一线治疗中可以改善肿瘤表达PD-L1至少50%的患者的总生存率。最近几年，ICI与化疗的结合已被证明能改善鳞状和非鳞状NSCLC患者的生存率，与PD-L1的表达无关。

多靶点描绘复杂的肿瘤微环境对于全面评估患者的预后和接受免疫抑制剂治疗的疗效，挖掘肿瘤微环境与肿瘤发生发展、复发、转移和耐药机制的关系和临床分子机理提供了全新的思路，依托下一代病理技术（NGP），即多重荧光免疫组化技术平台，阔然基因推出了肿瘤免疫微环境全景分析解决方案，助力于更精确的肿瘤免疫和其他药物开发应用。 本期NGP资讯，将为大家分享两篇NGP在肝细胞癌研究中的应用案例。 1 肝癌中浸润T细胞的景观揭示 随着癌症免疫疗法的发展，确定可预测治疗反应的稳健生物标志物至关重要。新型癌症免疫疗法的开发和有效生物标志物的鉴定需要对肿瘤浸润T细胞有深入的了解。 本研究通过六名肝细胞癌（HCC）患者的外周血、肿瘤和邻近正常组织中分离的5063 个单细胞RNA测序和TCR序列分析，根据其分子和功能特性识别出11个T细胞亚群，并描绘其发育轨迹。特定的亚群，如耗竭CD8+ T细胞和调节性T细胞（Tregs），会在HCC中优先富集，通过多重荧光免疫组化（mIHC）进一步证实了HCC中存在CD8+FOXP3+调节性T细胞，表明HCC微环境促进了浸润CD8+ T细胞向耗竭状态的转变。此外，我们鉴定了每个亚群的特征基因。其中编码layilin的LAYN与肿瘤浸润耗尽的CD8+ T细胞有关，导致HCC患者的不良预后。 总之，这份转录组数据揭示了HCC浸润T细胞的详细特征，为了解HCC浸润T细胞等免疫景观提供了宝贵的见解。 2 肝CD69+ CD103+ CD8+ 组织驻留记忆T 细胞的临床意义 自身免疫性肝炎 (AIH) 患者的肝脏中存在多种炎症反应，但对潜在致病亚群的鉴定仍缺乏有效的生物标志物。 研究者通过对比慢性乙型肝炎、非酒精性脂肪性肝病和健康人的组织，发现AIH患者肝内CD69+ CD103+ CD8+ TRM 细胞显著增加，且与疾病严重程度呈正相关。AIH患者肝内IL-15和TGF-β表达水平显著升高，且肝细胞广泛表达CD103配体- E-钙黏蛋白（E-cadherin），这些因素可能有助于CD8+ TRM细胞的分化和驻留。经过免疫治疗后，AIH患者肝内CD8+ TRM细胞数量显著下降。糖皮质激素可以通过直接下调CD8+ TRM细胞Blimp1的表达，从而抑制CD8+ TRM细胞的体外扩增。 该研究证实了CD69+ CD103+ CD8+ TRM 细胞在AIH发病机制中的重要作用，并可能是疾病持续进展和停药后容易复发的重要预测标志物，为探索新型免疫治疗靶点打下理论基础。 目前，阔然基因已经布局了整套多重荧光免疫组化技术（mIHC）平台，包括Kreep染色试剂盒、KR-HT5高通量荧光病理切片扫描系统和KRIAS医学病理影像分析软件，并开发了6款检测产品。 依托多重荧光免疫组化技术平台，阔然基因推出了肿瘤免疫微环境全景分析解决方案，全景剖析肿瘤免疫微环境中的杀伤性T细胞、耗竭性T细胞、巨噬细胞、B细胞、三级淋巴结构和免疫检查点受体的浸润情况，全面评估患者的预后和接受免疫抑制剂治疗的疗效，挖掘肿瘤免疫微环境与肿瘤发生发展、复发、转移和耐药机制的关系和临床分子机理。 文献汇编： [1] Cell. 2017 Jun 15;169(7):1342-1356.e16. [2] Hepatology. 2021;74(2):847-863

PD-1靶向抗体pembrolizumab仅对MSI-H的错配修复缺陷肿瘤有效，仅占转移性结直肠癌（CRC）病例的5%。因此，有必要了解CRC肿瘤微环境中细胞和分子重构的机制，进而寻找潜在的干预靶点，以提高免疫治疗的疗效。 研究者通过单细胞测序技术联合空间转录组学技术，发现肿瘤特异性FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞在14个独立CRC队列中(包含2550个样本)呈正相关。通过多重荧光免疫组化技术（mIHC）和空间转录组学验证其紧密定位，这种相互作用可能受到趋化素、TGF-β和白细胞介素-1的调控，而且可以刺激免疫排斥的结缔组织结构的形成，限制T细胞浸润。研究还发现FAP或SPP1高表达的患者在抗PD-L1治疗队列中获得的治疗效益较少。 该研究通过破坏FAP成纤维细胞和SPP1巨噬细胞相互作用来改善免疫治疗，提供了一种潜在的治疗策略。 目前，阔然基因已经布局了整套多重荧光免疫组化技术（mIHC）平台，包括Kreep染色试剂盒、KR-HT5高通量荧光病理切片扫描系统和KRIAS医学病理影像分析软件，并开发了6款检测产品。 依托多重荧光免疫组化技术平台，阔然基因推出了肿瘤免疫微环境全景分析解决方案，全景剖析肿瘤免疫微环境中的杀伤性T细胞、耗竭性T细胞、巨噬细胞、B细胞、三级淋巴结构和免疫检查点受体的浸润情况，全面评估患者的预后和接受免疫抑制剂治疗的疗效，挖掘肿瘤免疫微环境与肿瘤发生发展、复发、转移和耐药机制的关系和临床分子机理。 参考文献：Nat Commun.2022. DOI: 10.1038/s41467-022-29366-6

高鹏教授，博士生导师、泰山学者特聘教授、教育部新世纪优秀人才齐鲁医院病理科主任 山东大学基础医学院副院长 主持国家自然科学基金8项 在SCI期刊发表第一作者/通讯作者论文70余篇（包括10分以上论文6篇，单篇影响因子最高30.5分） 山东省医学会病理学会主任委员中国研究型医院协会病理学分会副主任委员中国病理医师协会常务委员 担任国家自然科学基金一审专家和二审专家 亚专科：乳腺病理、消化病理 几十年来，医学界一直在大力探索癌症治疗方法，化疗和放疗是传统的癌症疗法，但由于肿瘤的异质性和复杂的微环境，往往效果并不理想。近年来，医学界对肿瘤微环境的认识逐渐提高，这导致了免疫治疗的兴起。包括细胞疗法、治疗性疫苗和免疫检查点抑制剂在内的多种策略，已经在以前难以治疗的癌症中取得了令人惊讶的临床效果，并显著提高了生存率。免疫治疗正在成为癌症治疗的新标准，与手术、化疗、靶向疗法和放疗并列。目前，仅对针对PD-1/PD-L1的药物就有超过2000项免疫治疗试验正在进行。 在新的免疫治疗时代的肿瘤病理诊断中，多重荧光免疫组化这一新技术平台也在其中发挥着作用。高鹏教授表示，近年来病理医生比较关切的热点是两个方面，一个是肿瘤的分子治疗，另一个是肿瘤的免疫治疗。 对于肿瘤的分子治疗来说，比较强调肿瘤细胞本身的一些分子的改变，比如说有些异常的改变，再找到相应的靶点进行治疗。 肿瘤的免疫治疗则涉及到肿瘤和肿瘤周围的微环境相互的作用，特别是微环境中的免疫细胞。所以要充分了解肿瘤微环境的免疫细胞，包括它的种类，它和肿瘤细胞之间相互的关系。而多重荧光免疫组化可以同时检测肿瘤微环境中多种不同种类的免疫细胞，包括免疫细胞的品种、数量，以及它和肿瘤细胞相互之间的关系。了解肿瘤微环境中免疫细胞和肿瘤细胞相互之间的关系，一方面有助于了解患者的愈后，另一方面也为患者能否采用免疫治疗以及预测免疫治疗的效果带来很大的帮助。 高鹏教授认为，对于肿瘤微环境中多种免疫细胞的同时检测，多重荧光免疫组化是一个很好的检测方式。当然检测完了以后需要判读，他希望判断软件首先能够准确的区分出不同的免疫细胞。另外还希望能够知道肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互关系，比如肿瘤细胞和免疫细胞是否是共定位肿瘤内部的免疫细胞，肿瘤边缘的免疫细胞以及肿瘤周围的免疫细胞之间的空间关系等。另一方面，目前病理医生用的更多的是明场的光学显微镜，高鹏教授希望将来这个软件能提供荧光的暗场和明场之间方便地切换。 对于消化系统的肿瘤，高鹏教授介绍，一些特殊的分子治疗、免疫治疗已经进入到了临床阶段。比如和免疫治疗相关的微卫星不稳定性、dMMR检测已经在消化道的胃癌肠癌中作为规范性的检测，特别是在肠癌中几乎是做到了能检尽检。 微卫星不稳定性的检测对于二期肠癌化疗的选择非常有帮助，直接决定了二期的肠癌是否采用化疗。 更重要的是，它对于晚期的胃癌、结直肠癌是否采用免疫治疗也是至关重要的。所以说下一代病理技术已经在微卫星不稳定性所建议的免疫治疗中发挥作用。 同时，多重荧光免疫组化检测免疫微环境中的免疫细胞是另一个方向，它跟dMMR检测完全不同，显示的是肿瘤周围不同类型的免疫细胞的数量和品种，这些直接决定了患者的愈后，同时也直接决定了患者对免疫治疗的反应性。所以高鹏教授表示他也期待多重荧光免疫组化的免疫检测，能作为dMMR或者是PD-L1的补充，对将来的免疫治疗选择提供另一个很好的参考工具。

导管原位癌（DCIS）的治疗是为了预防随后的同侧浸润性乳腺癌（iIBC）。然而，许多DCIS病变永远不会变成侵入性病变。为了防止过度治疗，需要能够区分无害和潜在危险DCIS的预测标志物。 为了研究免疫微环境（IME）在DCIS向iIBC进展过程中发挥的关键作用，研究者利用多重荧光免疫组化技术（mIF）评估病例组（iIBC病变）和对照组（无iIBC病变）中CD20+ B细胞，CD3+CD8+ T细胞，CD3+FOXP3+ 调节性T细胞，CD68巨噬细胞和CD8+Ki67+ 增殖T细胞的密度、组成、与DCIS细胞的接近度。实验结果表明，较高的间质免疫细胞亚群的密度与较高疾病等级、ER阴性、HER-2阳性、Ki67≥14%、导管周围纤维化和粉刺样坏死显著相关，但在病例组和对照组之间没有显著差异。 该研究解析了DCIS的IME特征，尽管免疫细胞亚群及空间邻近距离的分析没有提供DCIS发展为ilBC的预测指标，但与已知的侵袭性复发相关的其他因素相关。 目前，阔然基因已经布局了整套多重荧光免疫组化技术（mIHC）平台，包括Kreep染色试剂盒、KR-HT5高通量荧光病理切片扫描系统和KRIAS医学病理影像分析软件，并开发了6款检测产品。 依托多重荧光免疫组化技术平台，阔然基因推出了肿瘤免疫微环境全景分析解决方案，全景剖析肿瘤免疫微环境中的杀伤性T细胞、耗竭性T细胞、巨噬细胞、B细胞、三级淋巴结构和免疫检查点受体的浸润情况，全面评估患者的预后和接受免疫抑制剂治疗的疗效，挖掘肿瘤免疫微环境与肿瘤发生发展、复发、转移和耐药机制的关系和临床分子机理。 参考文献：Br J Cancer.2022 DOI: 10.1038/s41416-022-01888-2

肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）反映了癌症中的适应性抗肿瘤免疫应答，通常与良好的预后相关。但是TILs亚群及其空间排列与免疫检查点抑制剂（ICI）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的临床益处之间的关系尚不明确。 在179例接受ICI治疗的NSCLCs肿瘤样本的多机构队列研究中，研究者利用多重荧光免疫组化技术（mIHC）确定了主要TILs亚群、PD-1、Lag3和TIM-3与预后的相关性。研究发现，CD8 T细胞是最丰富的亚群，基质CD8细胞毒性T细胞密度较高与存活期延长显著相关，在PD-L1阳性病例中更为突出。T细胞上高水平的LAG-3或RQI异质性指数升高与队列中较差的生存率相关。 该研究表明，基线T细胞密度和T细胞耗尽标志物表达可对接受ICI治疗的PD-L1阳性NSCLC患者进行分层，具有重要的推广性和转化潜力。 目前，阔然基因已经布局了整套多重荧光免疫组化技术（mIHC）平台，包括Kreep染色试剂盒、KR-HT5高通量荧光病理切片扫描系统和KRIAS医学病理影像分析软件，并开发了6款检测产品。 依托多重荧光免疫组化技术平台，阔然基因推出了肿瘤免疫微环境全景分析解决方案，全景剖析肿瘤免疫微环境中的杀伤性T细胞、耗竭性T细胞、巨噬细胞、B细胞、三级淋巴结构和免疫检查点受体的浸润情况，全面评估患者的预后和接受免疫抑制剂治疗的疗效，挖掘肿瘤免疫微环境与肿瘤发生发展、复发、转移和耐药机制的关系和临床分子机理。 参考文献：J Immunother Cancer. 2022 doi: 10.1136/jitc-2021-004440.