“使用‘NGP+NGS’技术，能够更准确更全面的评估肿瘤突变谱和免疫微环境相关标志物，在指导用药、疗效监测和预后评估以及新药研发方面……”，在3月28日南方医学网、基因谷联合专访中，阔然生物的联合创始人、常务副总经理张瑞如数家珍的介绍阔然生物的系列优势技术与产品。

初见张瑞，他亲切的问候，带有几分文人的优雅。谈吐中，保持着科研人员的低调和谦逊。

这次专访组也是提前做了功课，希望可以在访谈中，给大家真实呈现张瑞是如何从深耕十年的药物研发的领域转入精准医学赛道，带领团队成功进行创新性肿瘤精准医学研发的。

阔然生物成立于2015年，总部位于上海，专注于精准医学转化研究与应用，致力于提供多应用场景的一站式分子诊断解决方案，是国内首家可实现商业化落地的下一代病理分子诊断公司。阔然生物是国内唯一开启NGP平台二类医疗器械（KR-HT5）的申报的企业，拥有9款IVD产品注册申报储备，其中3款IVD产品于2022年获批欧盟CE认证。

“我之前长时间从事于药物的研发工作，重点是在仪器分析和药物分析这个领域，在这一领域积累了一定经验”谈及进入肿瘤诊疗领域，张瑞回忆道:“起因是我们是跟临床有大量的合作，通过跟临床医生的合作，我们逐渐进入到了肿瘤诊疗领域，首先是脑胶质瘤的检测。”

随着对肿瘤分子机制研究的进展，对于肿瘤的发生、发展、转化机制的日渐深入，我们很多研究成果包括靶向药、免疫制剂广泛的应用在临床领域。在这一背景下，分子诊断技术可以应用于肿瘤诊疗过程。因此在2018年这个节点上，基于NGS如火如荼的开展，同时依靠我们扎实的临床资源，阔然生物顺势而为进入了肿瘤分子诊断领域。

阔然生物从成立之初，就选择了从复杂的脑肿瘤检测开始。以张瑞为代表的研发团队，在没有太多前车之鉴下，面对研发的众多不确定性，克服了巨大的困难，最终成功开发了脑肿瘤检测产品，以及成功首创了“NGP+NGS”的病理分子诊断临床应用。

“困难有很多”，张瑞所带领的团队还是坚持下来了。

“这个动力真的是作为我们坚持下来的一个非常重要的精神支柱”张瑞在采访中神情凝重的跟我们讲述了患者用户给他带来的坚持动力。“每一位患者的希望凝聚起来就组成了我们阔然更大的希望。”

“在2019年，有个肿瘤晚期的外地患者经过多方求助找到了我们。我们为她做了全套的检测。”张瑞细细回忆起当时的画面。

“我们实验室的接收工作人员打开包裹后，除了样本以外，还附带了一个纸条，上面写着：感谢你们让我又拥有了希望。”

“这种情形是让我们非常感动的，我们确确实实地感受到了我们做这样的事情对患者以及患者家属都有很大的意义。我们的肿瘤分子诊断技术真真切切可以给肿瘤患者带来益处，这个是我们给临床带来的价值，这也是我们多年坚持下来的一个根本动力。”

因为阔然人希望给更多患者带来希望，患者也希望阔然可以给他们带来希望，阔然人也希望给行业带来希望。

从患者需求出发，践行精准医学使命。张瑞用“三个扩展”来阐述阔然生物的发展历程。

我们的发展总体上是“三个扩展”。首先我们是以中枢神经系统肿瘤，胶质瘤检测起家，第一个扩展是将胶质瘤扩展到其他神经性肿瘤，如脑膜瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤等；在建立了中枢神经系统肿瘤分子诊断壁垒情况下，我们进行了第二次扩展，我们将癌种扩展到其他的常见常发的肿瘤，肺癌，肠癌，肝癌等；第三步，我们把基于NGS技术的分子诊断扩展到了以多重荧光免疫组化为基础的下一代病理领域。

阔然生物的产品管线已经覆盖了主要的常见肿瘤，涵盖目前主流的分子诊断检测平台。从中枢神经系统肿瘤检测扩展到其他神经性肿瘤，如脑膜瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤等；完成中枢神经系统肿瘤产品布局后扩展到其他的常见常发的肿瘤，如肺癌，肠癌，肝癌等；顺应精准医学的发展，扩展到下一代病理。

“阔然生物持续走自主创新道路，首先提出了‘NGP（Next Generation Pathology）+NGS（Next Generation Sequencing）’的临床新应用，开启病理诊断结合分子诊断新模式，得到行业专家支持和临床医生认可。”

张瑞指出，NGP即下一代病理技术。2022年，中国科学院院士卞修武教授在《中华病理学杂志》上，首次提出了“下一代诊断病理学（next-generation diagnostic pathology）”概念，而下一代诊断病理学在肿瘤领域并非新事物，自2015年“精准医疗”理念提出后就开始随着基因组学时代萌芽并迅速发展，诞生了大批肿瘤NGS企业。如今，随着多组学研究和肿瘤免疫微环境（TME）研究的临床价值深入人心，肿瘤精准诊断正在从NGS向以多重荧光免疫组化（mIHC）技术为代表的下一代病理技术（NGP）发展。“NGP+NGS”技术相互补充，从DNA和蛋白质层面检测肿瘤预后、用药相关的分子标志物，全面评估肿瘤环境，可以确定最佳的治疗方案。

“NGP+NGS”技术，能够更准确更全面的评估肿瘤突变谱和免疫微环境相关标志物，在指导用药、疗效监测和预后评估以及新药研发方面都有独特的优势。

阔然生物基于“NGP+NGS”模式开发的临床检测产品，覆盖肿瘤治疗全周期，全面检测肿瘤免疫治疗相关突变基因、TMB和肿瘤免疫微环境中的TILs，扩大肿瘤PD-1/PD-L1抑制剂免疫治疗适应人群，同时提高免疫治疗受益人群的精准预测筛查。

“阔然生物的ctDNA MRD检测产品采用全外显子（WES）+panel的技术路线，融合了两种经典策略tumor naive和tumor informed的优势，一方面通过全外显子初检，全面检测患者基因突变图谱，一方面通过可定制的panel全面覆盖已知和新发突变，更全面进行动态监测。”

张瑞向专访组介绍到，阔然生物ctDNA MRD检测主要有5大优势。第一点是采用全外显子初检，实现最全面肿瘤突变图谱；第二点是血液MRD超高深度测序20万X，更灵敏更准确；第三点是MRD检测探针自主研发，65%分子回收率业内领先；第四点MRD检测灵敏度低至万分之一，比专家共识要求更进一步；第五点可以在panel基础上灵活个性化定制。

在MRD的研发布局上，张瑞称，阔然生物MRD检测产品在肺癌、胃肠肿瘤、泌尿系统肿瘤应用比较成熟，未来围绕神经肿瘤研发是重点方向。

多靶点描绘复杂的肿瘤微环境对于全面评估患者的预后和接受免疫抑制剂治疗的疗效，挖掘肿瘤微环境与肿瘤发生发展、复发、转移和耐药机制的关系和临床分子机理提供了全新的思路，依托下一代病理技术（NGP），即多重荧光免疫组化技术平台，阔然基因推出了肿瘤免疫微环境全景分析解决方案，助力于更精确的肿瘤免疫和其他药物开发应用。

本期NGP资讯，将为大家分享两篇NGP在膀胱癌研究中的应用案例。

肌样侵袭性膀胱癌（MIBC）每年会造成约20万人死亡。目前常用的治疗方法为新辅助化疗后根治性膀胱切除术和吉西他滨联合顺铂(GC)的化疗。但是绝大多数患者对免疫检查点抑制剂ICIs无反应。

研究者利用免疫排斥的MIBC小鼠模型探究对ICIs无反应的分子机制。分析发现GC治疗后促进COX-2的表达，进而使抑制性免疫刺激损伤相关分子模式iDAMP（前列腺素E2, PEG2）的释放，阻碍DC成熟，使得肿瘤浸润的CD3+ T 、CD4+T、CD8+ T含量下降。利用COX- 2特异性抑制剂Celecoxib（Celex，抗炎药物）后可促进DC的成熟。进一步发现，iDAMP阻断与化疗协同作用，能够增强免疫检查点反应。联合GC+Celex+anti-PD1三种治疗方法可以显著诱导CD3+T细胞浸润上皮肿瘤细胞区进而重塑肿瘤微环境。

总之，该研究结果证明了化疗、ICIs以及靶向iDAMP(COX-2)的联合治疗可以将膀胱癌的肿瘤微环境由免疫排斥转化为T细胞高浸润，为提高MIBC患者对化疗免疫治疗反应提供了理论指导。

膀胱癌（BC）是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤。免疫微环境中的癌症相关成纤维细胞(CAFs)在癌症治疗和患者预后的反应中发挥重要作用。

研究人员通过单细胞测序对BC患者的肿瘤组织和配对癌旁组织中的成纤维细胞进行了无监督聚类。除了常见的炎性成纤维细胞（iCAF） 和肌成纤维细胞（mCAF ） 外，还首次鉴定出一类高表达尿素转运子（SLC14A1）的成纤维细胞新亚群—irCAF（Interferon reguated CAF）。通过mIHC的Panel（CD45、COL1A1、cytokeratin 6、 SLC14A1、WNT5A ）确定了 BC肿瘤组织中存在SLC14A1+ irCAFs这一亚群，约占基质成纤维细胞总数的3%-65%。后续通过实验进一步证实了干扰素信号可以诱导这一亚群的分化，并通过分泌 WNT5A 活化肿瘤细胞 β-catenin 蛋白及其下游通路，从而增强肿瘤干性和介导化疗抵抗。

该研究进一步阐明了恶性肿瘤成纤维细胞亚群的多样性及其功能的差异性，对于开发靶向成纤维细胞的新型治疗方案有重要临床意义。

目前，阔然基因已经布局了整套多重荧光免疫组化技术（mIHC）平台，包括Kreep染色试剂盒、KR-HT5高通量荧光病理切片扫描系统和KRIAS医学病理影像分析软件，并开发了6款检测产品。

依托多重荧光免疫组化技术平台，阔然基因推出了肿瘤免疫微环境全景分析解决方案，全景剖析肿瘤免疫微环境中的杀伤性T细胞、耗竭性T细胞、巨噬细胞、B细胞、三级淋巴结构和免疫检查点受体的浸润情况，全面评估患者的预后和接受免疫抑制剂治疗的疗效，挖掘肿瘤免疫微环境与肿瘤发生发展、复发、转移和耐药机制的关系和临床分子机理。

参考文献：

[1] Nat Commun. 2022 Mar 28;13(1):1487.

[2] Cancer Cell. 2022 Dec 12;40(12):1550-1565.e7.

5月6日，动脉网对外发布了“2023未来医疗100强”榜单。未来医疗100强榜创立于2015年，由动脉网、VB100、蛋壳研究院共同推出的国内第一个针对非上市企业的创新医疗领域榜单，旨在遴选真正代表未来医疗的中国创新医疗者，发现我国未来医疗产业的核心力量，推动健康医疗产业的创新变革进程。阔然生物凭借卓越的创新产品技术及一站式分子诊断解决方案服务能力获得“澎橙奖·年度创新企业”的荣誉，已经连续两年登上未来医疗100强·中国创新医疗服务榜的榜单。

“澎橙”寓意鹏程万里，奖项专属色为橙色，是繁荣、力量、智慧、活力的象征，代表着拼搏革新的医疗健康领域参与主体的风貌与姿态。未来医疗100强·澎橙奖面向医疗健康领域的投资机构、企业、园区展开评选，重点考察候选单位在评审期内的年度表现与突破。

目前，阔然基因已经布局了整套多重荧光免疫组化技术（mIHC）平台，包括Kreep染色试剂盒、KR-HT5高通量荧光病理切片扫描系统和KRIAS医学病理影像分析软件，并开发了6款检测产品。

在2023第七届未来医疗100强·个性化诊疗论坛上，阔然生物常务副总经理张瑞先生做了“全析肿瘤免疫微环境，开拓病理诊断新未来”的主题演讲，简要分析了病理诊断行业的现状，并阐述了病理诊断和肿瘤免疫治疗的重要性。张瑞指出，我国肿瘤免疫治疗市场规模预计2025年可达889亿元，复合年增长率约为68.8%，但当前肿瘤免疫治疗预测标志物有效性有限，临床急需采用新技术从新的维度去发现新的预测免疫治疗分子标志物。针对行业痛点，阔然生物基于多重荧光免疫组化技术平台打造了包括Kreep染色试剂盒、Krast全自动染色机，KR-HT5高通量荧光病理切片扫描系统和KRIAS医学病理影像分析软件，实现从染色、成像、分析到数据挖掘的下一代病理一体化解决方案的提供，推动病理技术的革新与应用。同时，张瑞也借国内权威专家之言，呼吁病理科要积极拥抱新兴技术。2023年第七届未来医疗100强大会以“无问西东”为主题，诠释医疗创新拓路者的前行精神。“知行合一”是行路之智，“无问西东”是行路之勇。与阔然生物企业文化“融合 蜕变  知行有恒”异曲同工！作为国内首家可实现商业化落地的下一代病理分子诊断公司，阔然生物一直秉承“践行精准医疗”的使命，致力于推动健康医疗产业的创新变革进程，推动我国医疗事业发展。

2023年4月28日，由北京市希思科临床肿瘤学研究基金会、良医汇和研值圈联合主办的“第三届肿瘤黑科技年会（Cool Techs for Oncology，CTO）”于上海线下圆满召开，阔然生物凭借下一代病理技术（NGP）荣获“最受关注的肿瘤黑科技奖”。

近年来，随着对肿瘤研究的不断深入，越来越多的抗肿瘤新药和新技术问世。人工智能的飞速发展，ChatGPT的大火，更是让“黑科技”一词深入人心。2023年，众多抗肿瘤“黑科技”发展势头迅猛，目不暇接的各种前沿技术，一再刷新人们的认知世界。但所谓“肿瘤黑科技”，不仅仅要够炫酷，更要有足够的“临床价值”，实现真正的“为患者服务”。

技术介绍：多重荧光免疫组化技术（mIHC）是下一代病理（NGP）技术的典型代表，该技术基于酪氨信号放大原理，可以在一张FFPE组织切片中进行多种标志物染色，通过各种标志物在细胞上的表达状态识别不同细胞亚群，结合人工智能软件，将病理医生的局部判读转为客观算法，扩展到全片的定量计算，统计各个组织区域中细胞类型、密度，空间位置关系等信息。该技术有三大技术突破，分别解决了染色环节的抗体来源冲突的问题，可实现7-9种标志物的染色；解决了扫描成像环节的串色干扰问题，提高了图片的信噪比；还解决图像分析环节的定量分析标准化的问题。

技术优势：多重荧光免疫组化技术实现的是一个多标记方案，相较于传统技术，它的优势显著。首先，对于临床的珍稀微量样本，当样本量不足以满足临床的检测需求，通过mIHC的技术，一张切片即可满足病理诊断的需求，最大化地发挥了珍稀样本的价值。其次，mIHC技术实现的是单细胞尺度的定量分析，相较于传统病理技术的定性评估，或者是基于bulk cells的综合结果，检测结果更精准。空间表型也是mIHC最为重要的优势之一，在一张切片上实现多种标志物在细胞上的单表达或者共表达，可以鉴别罕见的甚至传统技术无法标记的细胞亚群，并表征细胞间的原位的空间位置关系，有助于临床挖掘更多的与肿瘤发生发展、预测性生物标志物相关的空间表型生物学信息。

临床应用场景：胶质瘤是神经外科最常见的原发性颅内恶性肿瘤，呈浸润性生长，侵袭性强，极易复发，严重影响患者的生存期和生存质量。2021版WHO中枢神经系统肿瘤分类对于胶质瘤的分子诊断进行了更新，其中，成人胶质瘤根据分子标志物可以分为少突胶质细胞瘤 IDH突变伴1p/19q共缺失、星形细胞瘤 IDH突变、胶质母细胞瘤 IDH野生型。在脑胶质瘤诊疗指南（2022版）中，推荐胶质瘤常用分子病理学检测指标IDH1、ATRX、TP53等可以通过免疫组化方法检测，对胶质瘤进行分子分型并指导用药。然而，医院多采用免疫组化方法检测上述指标，一个指标需要一张白片，对于肿瘤组织少的样本，则无法对上述指标开展逐一检测，限制了对患者的快速诊断和精准分型。此外，病理诊断多依赖于病理医生的主观经验，选取局部视野做定性的评估，不同病理医生的判读结果存在一定的差异性。因此，如何在有限的样本上快速得到更精确的检测结果，是一个需要解决的临床问题。项目介绍：由阔然生物与复旦大学附属华山医院、上海交通大学医学院附属瑞金医院、上海交通大学医学院附属仁济医院、上海交通大学医学院附属新华医院和上海同济医院共同参与的“基于多组学的脑胶质瘤个体化诊疗技术多中心临床试验”项目希望通过前瞻性、大样本、多中心临床试验，进一步验证人工智能多组学技术的有效性和可靠性，为未来实现临床新技术转化应用奠定基础。作为该项目一部分，多中心联合开展了基于mIHC的成人胶质瘤分子分型AI判断项目。通过检测与胶质瘤分型及预后相关的6个重要指标，挖掘新的预后标志物，实现更细亚群的分层及预后评估，并开发端到端全自动快速AI病理诊断系统。项目价值：基于多重荧光免疫组化平台，开发了端到端全自动快速AI病理诊断系统，建立了mIHC平台的胶质瘤预后评估系统，从单细胞水平的量化结果更精准地评估胶质瘤患者的预后。通过更加精准、全面的预后评估，对于患者个性化用药诊疗、随访及疾病控制等方面具有重要的临床价值。

多靶点描绘复杂的肿瘤微环境对于全面评估患者的预后和接受免疫抑制剂治疗的疗效，挖掘肿瘤微环境与肿瘤发生发展、复发、转移和耐药机制的关系和临床分子机理提供了全新的思路，依托下一代病理技术（NGP），即多重荧光免疫组化技术平台，阔然基因推出了肿瘤免疫微环境全景分析解决方案，助力于更精确的肿瘤免疫和其他药物开发应用。

本期NGP资讯，将为大家分享两篇NGP在肺癌研究中的应用案例。

肿瘤浸润性T淋巴细胞（TIL）在癌症生物学中有重要作用，但TIL表型与其对局部非小细胞肺癌 (NSCLC) 的预后相关性之间的关系尚不明确。

研究者入组了150名局部NSCLC患者的新鲜肿瘤和正常邻近组织。通过NGS、高维流式细胞术和多重荧光免疫组化（mIHC）等技术全面表征组织微环境，结果表明：TIL的浸润程度与局部NSCLC无显著的预后关系；实验数据确定了两种主要的免疫类型（IM1和IM2），可预测独立于临床特征的无复发生存期；IM2与不良预后相关，IM1与良好的预后相关；预后良好的亚组与缺乏抑制性受体的T细胞和存在三级淋巴结构有关。

该研究确定了NSCLC中两种主要的预后相关免疫类型，独立于患者的肿瘤特征和临床特征，值得在未来的研究中进行探索。

CD8+ T细胞对不同肿瘤新抗原的反应是同时发生的，但对反应之间的相互作用及其对 T 细胞功能和肿瘤控制的影响尚不明确。

为了研究T细胞对肿瘤的免疫过程及其和肿瘤新抗原的相互关系，研究者通过单细胞测序技术和多重荧光免疫组化技术（mIHC），在小鼠肺腺癌中发现：肿瘤中建立了免疫优势，CD8+ T细胞的扩张主要由最稳定结合MHC的抗原驱动；响应亚显性抗原的CD8+ T细胞富含了与免疫检查点阻断（ICB）反应相关的TCF1+ 祖细胞。CCR6+ TCF1+ 祖细胞对ICB反应的贡献很小；接种疫苗可消除CCR6+ TCF1+ 祖细胞并改善亚显性反应。

该研究表明通过免疫调节T细胞组细胞亚群，优化T细胞对亚优势新抗原的反应，可以获得更好的ICB反应。

目前，阔然基因已经布局了整套多重荧光免疫组化技术（mIHC）平台，包括Kreep染色试剂盒、KR-HT5高通量荧光病理切片扫描系统和KRIAS医学病理影像分析软件，并开发了6款检测产品。

依托多重荧光免疫组化技术平台，阔然基因推出了肿瘤免疫微环境全景分析解决方案，全景剖析肿瘤免疫微环境中的杀伤性T细胞、耗竭性T细胞、巨噬细胞、B细胞、三级淋巴结构和免疫检查点受体的浸润情况，全面评估患者的预后和接受免疫抑制剂治疗的疗效，挖掘肿瘤免疫微环境与肿瘤发生发展、复发、转移和耐药机制的关系和临床分子机理。

参考文献：

[1] Ann Oncol.2022 Jan;33(1):42-56.

[2] Cell.2021, 16; 184(19): 4996-5014

多靶点描绘复杂的肿瘤微环境对于全面评估患者的预后和接受免疫抑制剂治疗的疗效，挖掘肿瘤微环境与肿瘤发生发展、复发、转移和耐药机制的关系和临床分子机理提供了全新的思路，依托下一代病理技术（NGP），即多重荧光免疫组化技术平台，阔然基因推出了肿瘤免疫微环境全景分析解决方案，助力于更精确的肿瘤免疫和其他药物开发应用。

本期NGP资讯，将为大家分享两篇NGP在肝细胞癌研究中的应用案例。

三级淋巴结构 (TLS) 与许多癌症的良好预后相关。然而，TLS在肝内胆管癌（ICCA）中的预后价值和临床相关性仍不清楚。

研究人员通过多重荧光免疫组化技术（mIHC）对不同解剖亚区的TLS进行量化，针对肿瘤内区域（T评分）和肿瘤周围区域（P评分）建立评分系统，并分析TLS与总生存期 (OS) 相关性。研究表明：T评分与良好的预后呈正相关，而高P评分代表较差的生存期；相较于肿瘤周围区域，肿瘤内TLS中的T滤泡辅助细胞和调节性T细胞显著增加；T和P的评分将ICCA分为4个免疫类别，具有不同TLS分布和预后，其中IV类（TLS主要分布在肿瘤内）患者复发风险最低。

该研究证明了TLS的空间排列和丰度与预后显著相关，并提出了一种新的免疫分类来预测ICCA患者的生存率，为评估患者预后提供新途径。

EB病毒相关的肝内胆管癌（ICC）是一类特殊的ICC类型，6.6%的患者属于该类型，目前尚无针对其全面的组织学、肿瘤微环境和基因组特征描述。

本文利用多重免疫荧光免疫组化（mIHC），全外显子测序等技术，评估了303例非EB病毒相关和EB病毒相关的肝内胆管癌患者的分子特征，发现EB病毒相关的LEL亚型CD20+ B细胞和CD8+ T细胞的密度和比例显著增加，OS和PFS显著延长；肿瘤微环境免疫型(TMIT) I (PDL1-Tumor+/CD8 -High)在EBV型ICC中明显高于非EBV型ICC；同时揭示了EBV型ICC具有不同的分子突变模式。

本研究针对EB病毒相关的ICC组织进行肿瘤微环境和分子层面的分析，发现相当比例属于TMIT 型，提示该亚型的患者是免疫检查点治疗的潜在获益者。

目前，阔然基因已经布局了整套多重荧光免疫组化技术（mIHC）平台，包括Kreep染色试剂盒、KR-HT5高通量荧光病理切片扫描系统和KRIAS医学病理影像分析软件，并开发了6款检测产品。

依托多重荧光免疫组化技术平台，阔然基因推出了肿瘤免疫微环境全景分析解决方案，全景剖析肿瘤免疫微环境中的杀伤性T细胞、耗竭性T细胞、巨噬细胞、B细胞、三级淋巴结构和免疫检查点受体的浸润情况，全面评估患者的预后和接受免疫抑制剂治疗的疗效，挖掘肿瘤免疫微环境与肿瘤发生发展、复发、转移和耐药机制的关系和临床分子机理。

参考文献：

[1] J Hepatol.2021 Nov 15;S0168-8278(21)02178-4.

[2] J Hepatol.2021 Apr;74(4):838-849.